Мой Врачебный Журнал

Институт биоорганической химии

имени 
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова 
Российской Академии Наук

Роль апоптоза в патогенезе заболеваний

(начало)

Белушкина Н.Н.

Роль протеолиза в развитии апоптоза.

В настоящее время складывается впечатление о центральной роли протеаз в запуске и развитии процесса апоптоза. Причем, по-видимому, при апоптозе, в отличие от физиологического ответа клетки, действуют свои, характерные только для апоптоза, специализированные необратимые реакции протеолиза, катализируемые специфическими протеазами, относящихся к классу цистеиновых протеаз. Эта группа протеаз, названная каспазы (caspases), существует обособленно и функционирует как медиатор сигнала смерти. С - отражает механизм протеолиза. Т.е. в активном центре находится цистеин. Асп - обозначает аспарагиновую кислоту, которая узнается как субстрат, пептидная связь после нее подвергается гидролизу. Аза - окончание, свойственное ферментам. К настоящему времени в различных клетках млекопитающих обнаружено 10 каспаз, образующих ферментативный каскад, подобно ферментативному каскаду свертывающей системы крови или системы комплемента. Каспазы имеют высокую степень гомологии по своей аминокислотной последовательности, схожи по структуре и по субстратной специфичности. Они синтезируются в виде проферментов (30-50 кД), которые содержат 3 домена: N-концевой домен, большую субъединицу (20 кДа) и малую субъединицу (10 кДа). Во время активации каспазы подвергаются протеолитическому отщеплению N-концевого домена, отличающегося наибольшей вариабельностью как по размерам, так и по аминокислотной гомологии.

CaspaseЭтот процессинг между доменами сопровождается ассоциацией большой и малой субъединицей в гетеродимер с формированием активного центра. Кристаллическая структура двух каспаз (caspase-1 и caspase-3) определена: в обоих случаях гетеродимер ассоциирован в тетрамер с формированием 2 каталитических сайтов (рис. 5), Среди каспаз различают эффекторы, т.е. ферменты непосредственно гидролизующие структурные белки клетки, и индукторы - каспазы, которые принимают апоптотический сигнал и передают его на эффекторные каспазы. Среди молекулярных мишеней каспаз - эффекторов известны многие белки, деградация которых вызывает развитие необратимых процессов, характерных для апоптоза. Каким образом происходит регуляция активности каспаз в интактной клетке? Каспазы присутствуют в клетке конституционно (даже в нейронах, которые не обновляются на протяжении всей жизни), что позволяет индуцировать апоптоз быстро. Один из путей активации каспаз связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы-8 при взаимодействии Fas - лиганда с Fas-рецептором). Другой путь - активация каспазы-9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Вс1-2 (будет рассмотрено далее). Третий путь активации каспаз - при помощи гранзимов В - сериновой протеазы. Такой путь активации каспаз актуален в случае индукции апоптоза клетки цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые и секретируют эти ферменты. При таком способе активации каспаз необходимо присутствие порообразующих белков перфоринов, продуцируемых также цитотоксическими Т-лимфоцитами. В качестве мишеней гранзимов В известны каспазы 1, 3 и 9.

Апоптоз-специфическая фрагментация ДНК.

Одно из апоптотических событий реализуется в ядре клетки и заключается в фрагментации ДНК. Деградация ДНК является терминальной фазой апоптоза. В ходе деградации ДНК сначала происходит образование крупных фрагментов, содержащих примерно 300 тыс. пар оснований (тыс. п.о.), несколько позже - 30-50 тыс. п.о. Далее наступает следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, с формированием фрагментов, содержащих 180 п.о. (протяженность нити ДНК в нуклеосоме) или кратных им по величине. Именно эти фрагменты выявляются в виде "лесенки" при электрофорезе ДНК лизатов апоптотических клеток, который широко используется для идентификации апоптоза. Такая фрагментация ДНК связана с протеолитическим расщеплением специфического белка топоизомеразы II. Это белок выполняет структурную и ферментативную функции и участвует в формировании структур ДНК высшего порядка - суперспирализованных петель. Они содержат по 50 тыс. п.о. Шесть петель, объединенных в единую дисковидную розетку, образуют еще более сложную структуру и имеют в своем составе соответственно по 300 тыс. п.о. Следует напомнить, что именно на фрагменты по 50 и 300 тыс. п.о. расщепляется ДНК в начальной стадии деградации при апоптозе. Деградация топоизомеразы II каспазами является одной из причин фрагментации ДНК.

Также субстратом протеаз при апоптозе является гистон H1, который защищает ДНК от действия эндонуклеаз на межнуклеосомальном уровне. В результате этого расщепления происходит деградация ДНК на фрагменты порядка 180 п.о. и кратные им.

Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности различных эндонуклеаз. Мало сведений о характеристике эндонуклеаз, обусловливающих появление крупных фрагментов ДНК. Немногим больше сведений о процессах межнуклеосомальной деградации ДНК, в результате которой образуются фрагменты ДНК размером 180 п.о. Считают, что этот тип деградации обеспечивается активацией Са2+, Mg2+-зависимой эндонуклеазы.

Механизмы индукции апоптоза при повреждении ДНК.

До последнего времени считалось, что нерепарируемые повреждения ДНК приводят клетку к гибели в результате нарушения функций всех биохимических систем из-за невозможности полноценной транскрипции генов, содержащих дефекты в матрице ДНК. Исследования последних лет привели к формированию принципиально новых представлений о механизме гибели клеток, имеющих повреждения ДНК, как о процессе, осуществляемом в соответствии с определенной генетической программой. В индукции этой программы при наличии повреждений в ДНК клетки важная роль принадлежит белку р53. Этот белок с молекулярной массой 53 кДа локализован в ядре клетки и является одним из транскрипционных факторов, повышенная экспрессия которого приводит к репрессии ряда генов, регулирующих транскрипцию и причастных к задержке клеток в фазе клеточного цикла G1. При повреждении ДНК под действием ионизирующего излучения или УФ-излучения, ингибиторов топоизомеразы II и некоторых других воздействиях происходит активация экспрессии гена р53. Блок клеточного цикла в фазах G1 и G2 до репликации ДНК и митоза, соответственно, делает возможной репарацию поврежденной ДНК и предотвращает тем самым появление мутантных клеток. Если же активность репарационных систем недостаточна и повреждения ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется программируемая клеточная гибель, или апоптоз, что приводит к защите организма от присутствия клеток с поврежденной ДНК, т.е. мутантных и способных к злокачественной трансформации.

Роль p53На уровне транскрипции р53 регулирует экспрессию генов, участвующих в блокаде клеточного цикла - р21 (ингибитор большинства циклин-зависимых киназ, либо взаимодействует либо с комплексами, определяющими синтез и репарацию ДНК, либо с белками, модулирующими апоптоз - Вах. Последовательность рассмотренных событий представлена на рис. 7.

Мутации гена р53 позволяют таким клеткам сохранять жизнеспособность в митозе, что чревато выживанием клеток, подвергшихся опухолевой трансформации. И действительно, при онкологической трансформации обнаружено значительное количество мутаций гена р53. Мутации гена р53 связаны с плохим прогнозом в лечении злокачественных новообразований. Такие опухолевые клетки оказываются резистентными к лучевой и химиотерапии. И, наоборот, опухоли с нормальным (диким типом) р53 - легко поддаются лечению.

Таким образом, при действии генотоксических агентов р53 не только увеличивает время репарации ДНК. но также защищает организм от клеток с опасными мутациями. Блокирование процесса апоптоза, происходящее на разных стадиях канцерогенеза, приводит к снижению способности трансформированных клеток активировать программу клеточной гибели, что определяет прогрессию опухолевого заболевания.

Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза клетки.

Процесс регулированной клеточной гибели условно может быть разделен на несколько различных фаз: фаза инициации апоптоза, проведение сигнала, активация каспаз, активация эндонуклеаз и специфическая деградация ДНК, в результате чего наступает гибель клетки.

Индукция апоптозаЕсли начальные фазы различаются в зависимости от типа клеток и от апотоз-индуцирующего сигнала, то этап деградации ДНК - универсален для большинства клеток. Эта фаза является переходом к необратимой - терминальной стадии апоптоза, которую контролируют белки семейства Вс1-2, производные одноименных генов (рис. 8). В связи с этим, выяснение роли белков семейства Вс1-2 занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. К настоящему времени известно, что белки этого семейства относятся либо к индукторам апоптоза (Bad, Bax, Bcl-Xs, Bik, Bid, Bak), либо к ингибиторам (Bcl-2, Bcl-XL). Белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, что в конечном счете влияет на развитие апоптоза клеток. Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяют реостат жизни и смерти клетки. Механизм регуляции этого процесса целесообразно рассматривать с позиции структурно-функциональных взаимоотношений между белками этого семейства, которые позволяют объединить их в одно семейство - белков семейства Bcl-2.

продолжение в следующем номере журнала Esculapus info